SSB┃武汉大学刘天罡团队建立底盘宿主宿主白色链霉菌的代谢组分析方法
近日，武汉大学刘天罡教授团队，通过建立基于高分辨质谱技术的分析常用的异源表达宿主白色链霉菌的代谢组学方法，比较了异源生产不同多杀菌素产量的白色链霉菌J1074工程菌的代谢变化，相关研究成果以名为“Evaluation and optimization of analytical procedure and sample preparation for polar Streptomyces albus J1074 metabolome profiling”的研究论文在期刊Synthetic and Systems Biotechnology上发表。
微生物天然产物种类多，包括抗生素、抗肿瘤药物、杀虫剂等。其中，放线菌来源的天然产物在医药工业中占据重要的地位。然而，放线菌的培养方法复杂、周期长、且能进行遗传操作的放线菌较少。因此，在野生型菌株中开展研究工作面临多重困难。研究人员开发了利用模式链霉菌进行天然产物异源表达的方法，在模式菌株中合成多种天然产物，但是往往面临产量较低的困境，通过在异源宿主中进行随机性的遗传操作后产量提升效果也较为有限。主要原因在于链霉菌中代谢途径复杂，目前对链霉菌的代谢组学研究较为粗浅，研究人员对链霉菌的代谢网络认识不够完善。
多杀菌素是一种广谱低毒的绿色农作物杀虫剂，具有极高的研究价值。多杀菌素原产于刺糖多孢菌，但刺糖多孢菌遗传操作系统非常困难、发酵周期长且容易被污染。因此，研究人员采用将多杀菌素相关生物合成基因簇转入模式链霉菌中的方式进行产量提升等相关工作。前期刘天罡课题组首次在白色链霉菌中实现了多杀菌素的异源合成(菌株命名为OE3 [1])，随后又通过高效表达多杀菌素合成的聚酮合酶 (polyketide synthase, PKS)基因和聚酮骨架前体物质acyl-CoAs合成基因，结合培养基优化的策略，将多杀菌素的产量提升约50倍（菌株命名为ADE-AP [2]），该菌为目前在链霉菌中异源表达多杀菌素达到的最高产量。然而，在进行下一步有效的代谢工程改造时，需要深层次地了解白色链霉菌的代谢组学相关信息，明确菌株ADE-AP多杀菌素产量高于OE3的代谢层面的原因以及发酵后期菌株ADE-AP多杀菌素不再继续积累的可能因素。因此，在这篇文章中，作者开发了基于高分辨质谱全面分析白色链霉菌代谢组的方法，从菌株代谢的角度来回答这些问题。
在本篇研究中，作者利用118个代谢物的标准品建立了一个亲水作用液相色谱串联高分辨质谱分析方法，通过多批次数据的比较，证明了方法中保留时间的稳定性。鉴于微生物结构和分析目的的差异性，作者以野生型的白色链霉菌J1074为研究对象，对微生物代谢组样品前处理进行了优化，重点关注代谢组的淬灭和代谢物的提取，确定了白色链霉菌代谢组样品处理方法。
随后，作者利用此方法对白色链霉菌工程菌OE3和ADE-AP多杀菌素发酵过程中的动态代谢组变化进行了检测，结合自建数据库和多杀菌素合成代谢途径，总共鉴定了271个代谢物，建立了研究白色链霉菌的代谢组方法。通过对OE3和ADE-AP不同发酵时间的代谢差异的比较，重点分析糖酵解途径、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、氨基酸代谢、核苷酸代谢、多杀菌素合成糖基中间体代谢和能量辅因子代谢，分析得出菌株ADE-AP多杀菌素产量高于OE3的原因主要在于PKS基因和acyl-CoAs合成基因的高效表达，在对数期加强了ADE-AP菌株的代谢水平，积累了更多的前体物质为多杀菌素的合成打下夯实基础；在稳定期基因的高效表达使得菌株内代谢更有利于流向多杀菌素的合成，而不是初级代谢途径。发酵后期菌株ADE-AP多杀菌素不再继续积累与碳源、前体和能量供应不足有关。根据代谢组学分析的结果，作者认为多杀菌素的合成高度依赖于葡萄糖、丙酮酸、乙酰辅酶A和能量物质，因此未来在多杀菌素异源合成的代谢工程改造工作中，作者建议应该考虑这些物质的合理利用，可采用利用其他途径如脂肪酸降解途径加强乙酰辅酶A的供给，同时采用诱导性启动子控制基因高效表达，以避免蛋白质合成过程中能量的过度消耗。
图: 菌株ADE-AP和OE3的代谢变化
(A) ADE-AP和OE的多杀菌素产量
(B) 在发酵第3天 (对数期末期)、第5天 (稳定期中期)和第8天 (稳定期末期)，ADE-AP和OE3的代谢物强度比较
(C) 发酵第3天，ADE-AP和OE3的代谢比较，红色标记表示ADE-AP中代谢物的强度高于OE3，反之用蓝色标记，黑色标记表示代谢物未检出
(D) 发酵第5天，ADE-AP和OE3的代谢比较
(E) 发酵第8天，ADE-AP和OE3的代谢比较
本篇工作从剖析不同产量链霉菌代谢组差异的目的出发，建立了极性代谢组分析方法和白色链霉菌代谢组前处理方法，通过比较动态代谢组差异，为研究者更好地理解异源合成多杀菌素的菌株代谢提供了参考数据。本项工作建立了常用的异源表达宿主白色链霉菌的代谢组分析方法，此方法也可用于其他链霉菌代谢组分析。
文章名称：
Evaluation and optimization of analytical procedure and sample preparation for polar Streptomyces albus J1074 metabolome profiling
研究团队：
Shuai Fu，Ziheng An，Liangliang Wu，
Zilei Xiang，Zixin Deng，Ran Liu，Tian-gang Liu
文章路径：
扫码
或
点击阅读原文进入文章页面
Synthetic and Systems Biotechnology 是高质量国际开放获取期刊，创刊于2016年。期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域的各个方面。
Synthetic and Systems Biotechnology 发表的文章和期刊征稿活动将及时在公众号进行分享，欢迎学者们关注话题集#合成和系统生物技术（SSB），及时掌握期刊研究动态。
期刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus、CSCD等重要数据库收录。
2021年获得第一个影响因子：4.781，Q1区
2021CiteScore: 6.6，位列学科Q1区
期刊入选2019年中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊项目
期刊是中国生物工程学会合成生物学专业委员会的会刊
期刊是生物反应器工程国家重点实验室的官方期刊
推荐阅读
推荐阅读
KeAi
科爱出版